disusun oleh: imam prastiono

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Dahulu sebelum struktur DNA diketahui, para ilmuan tertarik pada kemampuan organisme membuat salinan yang layak dari dirinya sendiri, dan kemudian kemampuan sel memproduksi banyak salinan sama persis dengan makromolekul kompleks. Spekulasi tentang permasalahan ini terfokus pada konsep template. Template ini seharusnya menjadi permukaan dimana molekul berada dalam susunan yang khusus dan bergabung untuk membentuk makromolekul yang struktur fungsinya unik.

Proses replikasi DNA menunjukkan contoh biologi pertama dari penggunaan template untuk memandu sintesa makromolkeul. Tahun 1940an mengantrakan pada pengetahuan bahwa DNA merupakan molekul genetik, tetapi semuanya berubah ketika James Watson dan Francis Crick menyimpulkan struktur DNA yang menjelaskan begaimana DNA bekerja sebagai template untuk replikasi dan penyaluran informasi genetik.

Makhluk hidup terus tumbuh dan berkembang, hingga akhirnya mati. Saat makhluk hidup mengalami kematian, jumlah populasi di lingkungan akan mengalami penurunan yang dapat mengakibatkan ketidakseimbangan dalam sistem rantai makanan. Untuk itu makhluk hidup terus melakukan replikasi untuk mempertahankan populasinya di lingkungan. Tumbuhan, hewan, bakteri, jamur, dan manusia dalam mempertahankan kelangsungan jenisnya melakukan reproduksi. Reproduksi dengan cara meleburkan sel-sel gamet membentuk suatu kesatuan individu baru. Sebelum sel-sel gamet saling melebur, masing-masing dari DNA gamet bereplikasi untuk membawa sifat-sifat dari parentalnya, masing-masing 50%.

Tanpa adanya replikasi DNA di dunia ini dapat dipastikan semua sendi kehidupan akan mengalami kepunahan. Tidak akan ada lagi kehidupan .

Makalah ini disusun untuk memberikan penjelasan dan pemahaman tentang replikasi DNA,  Replikasi DNA merupakan mekanisme penggandaan DNA untuk membuat repliklat. Replikasi DNA penting agar DNA kita tidak termutasi. Prinsip dari replikasi itu sendiri adalah memasangkan n-TP atau nukleotida triposphat baru pada rantai tunggal / single strand DNA, dimana replikasi DNA sangat berperan penting dalam menunjang sistem reproduksi tubuh. Selain itu juga untuk mengetahui jenis replikasi DNA dan proses terjadinya replikasi DNA pada sel eukariot dan prokariot dan juga untuk mengetahui faktor yang berpengaruh dalam replikasi DNA.

1.2  Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari makalah Replikasi DNA ini, antara lain:

  1. Apakah pengertian replikasi DNA?
  2. Jenis-jenis replikasi DNA?
  3. Bagaimana proses terjadinya replikasi DNA?
  4. Perbedaan antara proses replikasi DNA pada sel eukariot dan prokariot?
  5. Apakah manfaat dan peranan replikasi DNA bagi tubuh?
  6. Faktor-fakt
  7. or yang mempengaruhi replikasi DNA?

1.3  Tujuan

Tujuan pembuatan makalah ini diantaranya adalah:

  1. Memahami pengertian replikasi DNA
  2. Mengetahui jenis replikasi DNA
  3. Mengetahui proses terjadinya replikasi DNA pada sel eukariot dan prokariot
  4. Memahami manfaat dan peranan replikasi DNA bagi tubuh
  5. Mengetahui faktor yang mempengaruhi replikasi DNA

BAB II

ISI

2.1 Pengertian Replikasi DNA

Struktur DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida. Rantai DNA memiliki lebar 22–24 Å, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 Å. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai.

Replikasi merupakan proses pelipatgandaan DNA. Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA yang digandakan. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel akan membelah diri. Pada setiap sel, kecuali sel gamet, pembelahan diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semua sel turunan memiliki informasi genetik yang sama.

Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari dua rantai dan rantai yang satu merupakan “konjugat” dari rantai pasangannya. Dengan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan dapat dengan mudah dibentuk.

2.2 Jenis Replikasi DNA

  1. Replikasi konservatif : Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNA awal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru
  2. Replikasi semikonservatif : tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehingga kedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun, masing-masing untai ini tetap dipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untai polinukleotida baru
  3. Replikasi dispersif : kedua untai polinukleotida mengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotida yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru

Replikasi semikonservatif

2.3 Proses Terjadinya Replikasi DNA

Di antara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation.
Percobaan ini dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl.

Model replikasi semikonservatif memberikan gambaran bahwa untaian DNA induk berperan sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untaian DNA baru, dengan demikian, salah satu bagian yang sangat penting dalam proses replikasi DNA  adalah denaturasi awal untaian DNA yang merupakan proses enzimatis. Denaturasi awal terjadi pada bagian DNA yang disebut ORI. Untaian DNA membuka membentuk struktur yang disebut garpu replikasi (replication fork). Garpu replikasi akan bergerak sehingga molekul DNA induk membuka secara bertahap.  Masing-masing untaian DNA yang sudah terpisah, berfungsi sebagai cetakan untuk penempelan nukleotida-nukleotida yang akan menyusun molekul DNA baru. Sekuens basa nitrogen DNA baru sesuai dengan sekuens basa cetakan DNA komplementernya.

Replikasi DNA berlangsung dalam tahapan :

1) Denaturasi (pemisahan) untaian DNA induk

2) Inisiasi sintesis DNA

3) Pemanjangan untaian DNA

4) Ligasi fragmen DNA

5) Terminasi sintesis DNA

Sintesis untaian DNA yang baru akan dimulai segera setelah ke dua untaian DNA induk terpisah membentuk garpu replikasi. Pemisahan dilakukan oleh enzim DNA helikase.
Kedua untaian DNA induk menjadi cetakan dalam orientasi 5’-P ke arah 3’-OH. Jadi, ada dua untaian DNA cetakan yang orientasinya berlawanan. Garpu replikasi akan membuka secara bertahap. Sintesis untaian DNA baru yang searah dengan pembukaan garpu replikasi akan dapat dilakukan dilakukan tanpa terputus (kontinyu) terhadap untaian DNA awal (leading strand). Sebaliknya, tahap demi tahap (diskontinyu),dilakukan terhadap untaian DNA lambat (lagging strand). Mekanisme replikasi DNA berlangsung secara semidiskontinyu karena ada perbedaan mekanisme dalam proses sintesis kedua untaian DNA. Fragmen-fragmen DNA hasil replikasi diskontinyu (fragmen Okazaki) akan disambung (ligasi) dengan enzim DNA ligase.

Polimerisasi DNA hanya dapat dimulai jika tersedia untai DNA molekul primer. Dalam replikasi DNA in vivo, molekul primer berupa molekul RNA berukuran 10-12 nukleotida. In vitro, misal pada Polymerase Chain Reaction (PCR) diperlukan DNA sebagai molekul primer. Fungsi molekul primer  menyediakan ujung 3’-OH yang akan digunakan untuk menempelkan molekul DNA pertama dalam proses polimerisasi. Sintesis RNA primer dilakukan oleh kompleks protein yg disebut primosom (primase + beberapa protein lain). Diperlukan lebih dari 1 primer untuk proses sintesis pada untaian DNA lambat (lagging strand).

Pada prokariot, polimerisasi dikatalisis DNA polimerase III. Dissosiasi enzim ini dari DNA cetakan terjadi saat bertemu dengan ujung 5’-P DNA primer yang menempel pada bagian lain. DNA primer pada fragmen Okazaki, didegradasi oleh aktivitas eksonuklease yang ada pada enzim DNA polimerase. Bagian RNA yang terdegradasi, diisi oleh molekul DNA, meskipun antar fragmen masih ada celah. Celah terbentuk karena belum ada ikatan fosfodiester antara ujung 3’-OH pada nukleotida terakhir yang disintesis oleh DNA polimerase dengan ujung 5’-P fragmen DNA yang ada didekatnya. Celah ini akan disambung oleh DNA ligase dengan menggunakan NAD atau ATP sebagai sumber energi. Pada untai DNA awal (leading strand) hanya diperlukan satu molekul primer pada titik awal replikasi. Untaian DNA baru disintesis dengan aktivitas DNA polimerase III secara kontinyu.

2.4 Proses Replikasi DNA pada sel eukariot dan prokariot

Replikasi DNA prokariot

Replikasi DNA kromosom prokariot, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ORI pada E. coli, misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA, yang masing-masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi, DNA kromosom prokariot dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ORI yang baru terbentuk, sebelum putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom yang sebagian telah bereplikasi.

Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga 40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP. Daerah ORI akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan ATP sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan enzim helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan memisahkannya.

Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (SSB) untuk melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau menginisiasi sintesis pada untai pengarah.

Agar replikasi dapat terus berjalan menjauhi ORI, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain, yaitu topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah berlanjutnya replikasi DNA bakteri.

Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase DnaB dan DNA primase.

Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami elongasi dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.

Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e, yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa eksonuklease 3’ 5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.

Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai aktivitas polimerase 5’3’, eksonuklease 5’3’, dan eksonuklease penyuntingan 3’5’. Eksonuklease 5’3’ membuang primer, sedangkan polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan dipersatukan oleh enzim DNA ligase. Secara in vivo, dimer holoenzim DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.

Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180°C dari ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan oleh enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.

Replikasi DNA eukariot

Pada eukariot replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi pada masing-masing ORI.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariot bergerak hanya dengan kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan mamalia.

Sederetan pasangan sekuens yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukomatin, sedangkan deretan yang agak lambat adalah heterokromatin. DNA sentromir dan telomir bereplikasi paling lambat. Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.

Seperti halnya pada prokariot, satu atau beberapa DNA helikase dan SSB yang disebut dengan protein replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen (PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi yang mengenali BUdR.

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariot (telomir) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut. RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’.

Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel. Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati. Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase.

2.5 Replikasi bahan genetik

Replikasi bahan genetik memerlukan beberapa komponen utama yaitu :
1. DNA cetakan

  1. Molekul deoksi ribonukleotida : dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP
  2. Enzim DNA polimerase : enzim utama yg mengkatalisa polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA
  3. Enzim primase : mengkatalisis sintesis primer untuk memulai replikasi DNA
  4. Enzim helikase : pembuka ikatan untaian DNA induk. Dibantu oleh enzim girase
  5. Protein SSB (single strand binding protein) : menstabilkan untaian DNA yg sudah terbuka

Enzim DNA ligase : menyambung fragmen-fragmen DNA

2.6 Mekanisme pengenalan terjadinya error saat pemasangan basa nukleotida baru

Selama polimerisasi, perbedaan antara nukleotida yang benar dan yang tidak benar bergantung pada ikatan hydrogen yang mengkhususkan pasangan yang benar antara basa yang saling melengkapi. Basa yang salah tidak akan membentuk ikatan hydrogen yang benar dan dapat dihilangkan sebelum ikatan pospodiester terbentuk. Keakuratan reaksi polimerisasi tidak cukup menghitung tingkatan keakuratan pada proses replikasi. Pengukuran menunjukan bahwa DNA polimerisasi memasukan satu nukleotida yang salah untuk setiap 104 sampai 105 nukleotida yang benar. Kesalahan ini sering terjadi karena basa dalam bentuk tautomerik yang tidak biasa, basa berada pada ikatan hydrogen dengan pasangan yang salah. DNA polimerase selain bertugas untuk memanjangkan strain baru, enzim ini juga memiliki fungsi sebagai proofreader. Proofreader adalah mekanisme pengenalan terjadinya kesalahan pasang pasangan basa nukleotida. Karena pada stain primer berfungsi sebagai cetakan, maka apabila ada basa nukleotida baru yang masuk dan tidak sesuai dengan cetakan, maka kesalahan tersebut akan langsung dikenali oleh DNA polimerase, dan akan langsung dibuang untuk digantikan dengan basa nukleotida baru lainnya. Tingkat kesalahan kemudian dikurangi dengan mekanisme tambahan enzim. Enzim yang berperan dalam proses ini adalah DNA Topoisomerase I dan DNA Topoisomerase II yang fungsinya adalah memperbaiki dengan cara memotong salinan DNA yang salah, akan tetapi untuk enzim topoisomerase II, khusus untuk menangani masalah yang lebih rumit. Prinsip kerja dari enzim Topoisomerase I adalah mengatasi terjadinya kerumitan. Hakekat mekanisme pada hampir semua DNA polymerase adalah memisahkan aktivitas eksonuklease 3’_5’ yang menyediakan pemeriksaan ganda masing-masing nukleotida setelah ditambahkan. Aktivitas nuklease mengakibatkan hilangnya nukleotida yang baru ditambahkan oleh  enzim, dan cenderung dikhususkan pada pasangan basa yang salah pasangan. Jika nukleotida yang salah telah ditambahkan, translokasi polymerase ke posisi dimana nukleotida berikutnya ditambahkan akan dihalangi.

Aktivitas eksonuklease 3’5’ menghilangkan kesalahan pemasangan nukleotida, dan polymerase akan dimulai kembali. Aktivitas ini disebut proofreading, aktivitas yang mempercepat terjadinya reaksi polimerisasi, karena pirofospat tidak terlibat. Aktivitas polimerisasi dan proofreading DNA polymerase dapat diukur secara terpisah. Pengukuran tersebut menunjukan bahwa proofreading meningkatkan keakuratan reaksi polimerisasi dari lipatan 102 sampai 103. Pemisahan basa yang benar dan tidak benar tergantung pada interaksi pasangan basa yang sama yang digunkanan selama polimerisasi. Strategi peningkatan keakuratan dengan interaksi nonkovalen yang saling melengkapi untuk pemisahan dua kali dengan tahapan yang berurutan sangat umum dalam sintesis informasi yang mengandung molekul. Strategi yang sama digunakan untuk meyakinkan keakuratan sintesis protein Secara keseluruhan, DNA polymerase melakukan kesalahan setiap 106 sampai 108 basa yang ditambahkan. Keakuratan replikasi sel E. coli yang telah diukur menunjukan tingkatan tinggi. Sisa tingkatan akurasinya dihitung dengan sistem enzim terpisah yang memperbaiki kesalahan pemasangan pasangan basa yang terjadi setelah replikasi. Proses ini disebut perbaikan kesalahan pemasangan (mismatch repair).

Kerja Topoisomerase I itu berlangsung secara spontan, hanya memotong satu untai DNA (selanjutnya langsung disambung kembali), mempunyai mekanisme ligasi dan nukleasi. Karena kinerjanya yang spontan inilah mengapa enzim Topoisomerase I tidak membutuhkan ATP untuk beroperasi.

Berbeda dengan enzim Topoisomerase I, pada enzim Topoisomerase II beroperasi dengan membutuhkan ATP, dan untuk memperbaiki kesalahan, terdapat dua rantai DNA yang dipotong.



Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s